Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201. 65 Биология




Скачать 41,96 Kb.
НазваниеМетодические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201. 65 Биология
страница1/3
Дата03.02.2016
Размер41,96 Kb.
ТипМетодические рекомендации
  1   2   3
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ им. Х.М.БЕРБЕКОВА

____________________________________________________________________


МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ,

ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСОВ


Методические рекомендации по организации самостоятельного

изучения курса «Общая вирусология»

Для специальности 020201.65 – Биология





Нальчик - 2010

УДК 576.858(075.8)

ББК 52.63я73

Б-69

Рецензент:

кандидат биологических наук,

старший преподаватель кафедры микробиологии, гигиены и санитарии

Кабардино-Балкарской государственной

сельскохозяйственной академии

М.Х. Пежева

Составитель: Блиева Лариса Заурбековна

Методы культивирования, индикации и идентификации вирусов: Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология». - Нальчик: Каб.-Балк. ун-т, 2010.- 48 с.


В методических рекомендациях представлены современные методы исследования вирусов. Описываются особенности работы с вирусами, методы их культивирования, индикации и идентификации.

Издание рассчитано на самостоятельную работу при подготовке к лабораторным занятиям студентов, обучающихся на 3 курсе по специальности «Биология».


Рекомендовано РИС университета


УДК 576.858(075.8)

ББК 52.63я73

Б-69

Кабардино-Балкарский

государственный университет, 2010

ВВЕДЕНИЕ

В методических рекомендациях по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» предлагаются методики самостоятельного изучения студентами основ культивирования, индикации и идентификации вирусов.

Согласно учебному плану по специальности 020201.65 студентам 3 курса Биологического факультета в течение одного семестра преподаётся дисциплина «Микробиология, вирусология».

Вирусология – медико-биологическая наука, изучающая вирусы: их строение, биохимию, систематику, генетику, а также значение в жизни человека.

В результате изучения вирусологии студенты должны знать особенности вирусов, овладеть практическими навыками и умениями в заборе материала для вирусологических исследований, проведении лабораторных методов диагностики заболеваний и в оценке их результатов. При изучении вирусологии используются знания, полученные студентами при прохождении общей биологии, гистологии, биохимии, генетики, физиологии.

Общий объём дисциплины «Микробиология, вирусология» составляет 210 часов, из которых 68 часов аудиторных и 142 часа на самостоятельную работу. Согласно учебно-тематическому плану на освоение вирусологии отводится 38 часов, из которых 10 часов аудиторных и 28 часов на самостоятельную работу.

Существующие учебники и практические руководства не отражают всех вопросов, затрагиваемых в этом курсе. Настоящие методические рекомендации разработаны по темам соответствующим лабораторным занятиям и содержат методы не представленные в лабораторном практикуме.

Основное внимание уделено современным методам применяемым в вирусологии, вместе с тем студенты знакомятся с фундаментальными принципами и нюансами вирусологических методов исследования.

В данное издание включены разделы: 1 – культивирование вирусов; 2 – индикация и идентификация вирусов. Собраны: описание подготовки материала для вирусологических исследований, методы обработки вируссодержащего материала, выделение и культивирование вирусов различными способами, методы индикации и идентификации вирусов и молекулярно-генетические методы исследования в диагностике вирусных инфекций. К каждому разделу даётся перечень контрольных вопросов, тематика докладов о результатах самостоятельной работы и список рекомендуемой литературы.


Раздел 1. Культивирование вирусов


1.1. Подготовка материала для вирусологических исследований


1.1.1. Правила работы в вирусологической лаборатории

В вирусологической лаборатории проводят работу по выделению штаммов вирусов, их идентификации и культивированию, выполняются различные научные исследования. При работе с вирусами необходимо прежде всего:

  1. Не допустить загрязнения штаммов вирусов посторонней микрофлорой;

  2. Обеспечить безопасность работающего персонала от возможного заражения вирусами;

  3. Обеспечить безопасность окружающего населения от заражения вирусными инфекциями через сточные воды, трупы экспериментальных животных и т.п.

Методы исследования, применяемые в вирусологии отличаются значительной сложностью, что связано прежде всего с абсолютным внутриклеточным паразитизмом вирусов и их малыми размерами.

При исследовании материалов, полученных от больных вирусными инфекциями, с целью лабораторной диагностики этих заболеваний применяются различные методы:

  • Методы электронной и в меньшей степени световой микроскопии;

  • Методы выделения и культивирования вирусов в культурах клеток;

  • Методы выделения и культивирования вирусов в развивающихся куриных эмбрионах и в организме чувствительных экспериментальных животных;

  • Выявление вирусов по их гемагглютинирующей способности;

  • Различные серологические методы исследования: традиционные и экспресс-методы;

  • Молекулярно-генетические методы исследования – молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция.

1.1.2. Материалы, исследуемые при вирусных инфекциях

При взятии инфекционного материала от людей и животных необходимо учитывать тропизм вирусов к определённым тканям и органам, пути выделения вируса во внешнюю среду и особенности патогенеза той или иной вирусной инфекции.

Различают пневмотропные, энтеротропные, гепатотропные, лимфотропные, нейротропные и дермотропные вирусы. В зависимости от тропизма исследованию подвергают различные материалы. Например, исследуют слизь из зева, мокроту и т.п., если виру пневмотропный; испражнения – при энтеротропных вирусах; жидкость из визикул или пустул, корочки – если вирус обладает дермотропностью и т.д.

1.1.3. Обработка вируссодержащего материала

Инфекционные материалы, взятые с учётом тропизма вирусов и с соблюдением асептики, помещают в стерильную посуду, тщательно закупоривают её и направляют в лабораторию, поместив в термос со льдом.

Материал рекомендуется исследовать в кратчайший срок, так как вирусы быстро инактивируются. Сохранению вируса способствует помещение исследуемого материала (в 50%-ном растворе глицерина) в холодильник при температуре не выше 5оС. Но самый надёжный способ – это хранение в замороженном состоянии при температуре -45оС и ниже; в таких условиях вирус может оставаться жизнеспособным длительное время.

Обработка плотного материала, содержащего вирусы, начинается с растирания его в ступке или измельчения в специальных аппаратах – гомогенизаторах. Затем готовится 10%-ная взвесь в солевом растворе, которую центрифугируют при 2000-3000 об/мин в течение 15-30 минут для осаждения крупных частиц. Вирусы остаются в надосадочной жидкости, которую и подвергают дальнейшему исследованию.

Жидкий вируссодержащий материал непосредственно центрифугируют и также получают надосадочную жидкость.

Если есть сомнения в бактериологической стерильности исследуемой вируссодержащей надосадочной жидкости, к ней добавляют антибиотики, чтобы уничтожить посторонние микроорганизмы. Антибиотики не влияют на вирусы, и они сохраняют свою жизнеспособность.

1.1.4. Микроскопические методы исследования в вирусологии

- Электронная микроскопия

Электронноскопические препараты готовят из очищенных и концентрированных вируссодержащих взвесей или ультратонких срезов тканей, заражённых вирусами. Вирусные объекты наносят на специальные плёнки-подложки, помещённые на опорные сеточки. Плёнки-подложки должны быть очень тонкими (не более 30 нм толщины), прозрачными и достаточно прочными, например, коллоидийно-угольные. Плёнки наносят на поддерживающие сеточки из меди (диаметром 2-3 мм) с многочисленными отверстиями. Далее препараты обрабатывают различными способами.

Методы напыления металлами применяют для получения контрастных препаратов. Пары тяжёлых металлов (золота, платины, урана и др.), образующиеся в специальном приборе в условиях вакуума и высокой температуры, направляют под острым углом на вируссодержащий препарат. Вирусы оказываются покрытыми тонким слоем металла.

Метод негативного контрастирования основан на том, что при обработке препарата некоторыми солями тяжёлых металлов, например, 1-2%-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, создаётся более плотный слой, не пропускающий электроны, а котором хорошо видны более электроннопрозрачные исследуемые объекты.

Метод ультратонких срезов в сочетании с негативным контрастированием является наилучшим для изучения тонкого строения вирионов и изучения этапов взаимодействия вирусов с клеткой, но в то же время он наиболее сложен. Исследуемые кусочки инфицированной ткани или другого вируссодержащего материала фиксируют в специальном фиксаторе (например, осмиевом). Обезвоживают путём последовательного помещения в спирты возрастающей крепости. Заливают образцы специальной пластмассой, после полимеризации которой образуются твёрдые прозрачные блоки. Из блоков готовят ультратонкие срезы толщиной 10-20 нм на специальном микротоме, Полученные срезы контрастируют, помещая в раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты.

Приготовленные вышеописанными способами препараты изучают в просвечивающем электронном микроскопе, разрешающая способность которого достигает 0,2-0,3 нм. Изображение препарата наблюдают на флюаресцирующем экране электронного микроскопа и фотографируют специальные фотопластинки, с которых получают отпечатки. Получаемые увеличения: ×100000-×400000.

Сканирующая электронная микроскопия осуществляется с помощью сканирующего электронного микроскопа, в котором тонкий пучок электронов быстро перемещается по исследуемому объекту, то есть сканирует его поверхность. В результате возникает излучение вторичных электронов, которое, проходя через катодно-лучевую трубку, преобразуется в объёмное изображение объекта на флюоресцирующем экране.

Сканирующая микроскопия позволяет получать трёхмерное изображение вирионов (предварительно препарат напыляют металлами), различать детали строения их поверхности, но не выявляет их внутреннюю структуру. Разрешающая способность сканирующего микроскопа равна 7-20 нм.

- Световая микроскопия

В световом микроскопе можно увидеть крупные вирусы, размеры которых находятся в пределах разрешающей способности микроскопа - не менее 0,2 мкм. А также внутриклеточные включения в поражённых вирусом тканях.

Крупные вирусы, например, поксвирусы, и включения обнаруживают с помощью специальных методов окраски, в фазовом контрасте, в тёмном поле зрения; применяют и люминесцентную микроскопию.

Крупные вирусы выявляют путём окраски по Морозову (серебрением). Для выявления внутриклеточных включений приготавливают гистологические срезы из поражённых тканей, препараты-мазки или отпечатки. Обычно препараты окрашивают по Романовскому-Гимзе, иногда другими методами. Наибольшее практическое значение имеет обнаружение включений Бабеша-Негри в нервных клетках головного мозга при бешенстве. Для этого препараты окрашивают по Манну.

Люминесцентная микроскопия. Препараты, приготовленные из материалов, содержащих крупные вирусы, внутриклеточные включения, скопления вирусных антигенов, окрашивают растворами флюорохромных красителей. При люминесцентной микроскопии в УФ-свете окрашенные акридин-оранжевым скопления РНК-геномных вирусов и образуемые ими включения видны как светящиеся красные гранулы на фоне бледно-зелёной цитоплазмы клеток; ДНК-геномные вирусы дают изумрудно-зелёное свечение.

Иммунофлюоресцентный метод основан на соединении вирусов, внутриклеточных включений, скоплений вирусных антигенов со специфическими противовирусными антителами, меченными флюорохромными красителями. Образовавшиеся комплексы дают свечение при люминесцентной микроскопии.


1.2. Культуры клеток в вирусологии и методы их получения

Культура клеток – клетки какой-либо ткани животных или человека, способные расти и размножаться в искусственных условиях.

Культуры клеток широко применяются при диагностике вирусных инфекций, в производстве вакцин, незаменимы при проведении научных исследований в области вирусологии.

Для успешного получения клеточных культур и последующего размножения в них вирусов культивируемые клетки должны постоянно находиться в сбалансированной физиологической среде, содержащей все необходимые компоненты для их жизнедеятельности и размножения.

Питательные потребности клеток обеспечиваются наличием незаменимых аминокислот (таких, как глутамат, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, аргинин, гистидин, метионин, треонин, цистин, тирозин), витаминов (особенно комплекса В), глюкозы и сыворотки крови.

Изотоничность и буферность среды поддерживается с помощью неорганических солей. Оптимальным является рН 7,2-7,4, при длительном культивировании клеток значение рН должно оставаться в пределах 6,8-7,8. Постоянство рН в течение нескольких дней обеспечивается присутствием карбонатного и фосфатного буферов. Стабилизации значения рН способствует выращивание культур в пробирках и флаконах, закрытых резиновыми пробками, вследствие чего не улетучивается СО2 (в противном случае это привело бы к сдвигу рН в щелочную сторону).

Контроль за реакцией среды осуществляется путём добавления индикатора фенолрот: при рН 6,8-7,2 среда имеет жёлтый цвет, при рН 7,2-7,4 – оранжево-розовый, при рН 7,4-7,6 – красный, при рН 7,7-7,8 – красно-фиолетовый.

Во время приготовления клеточных культур к солевым растворам и питательным средам нередко добавляют антибиотики, чтобы избежать бактериального и грибкового загрязнения. Применяют пенициллин и стрептомицин (по 60 000 ЕД/мл), тетрациклины, доксициклин, другие антибиотики широкого спектра действия в концентрации 0,1-0,01 мг/л; противогрибковые антибиотики – нистатин (20 ЕД/мл) и фунгизон.

Для приготовления питательной среды требуется вода высокой степени очистки, так как культура клеток очень чувствительна к ионам тяжёлых металлов. Рекомендуется применять бидистиллированную воду, перегнанную в стеклянных аппаратах или очищенную в ионообменных колонках.

Работу с культурами клеток проводят в тщательно обработанной «вирусологической» посуде из специальных сортов стекла или пластиковой посуде из полистерола для одноразового использования.




Рис. 1. Лабораторная посуда для выращивания культур клеток

Приготовленную культуру клеток инкубируют в термостате при температуре 36,0-38,50С.

1.2.1. Питательные среды

Питательные среды для клеточных культур в большинстве случаев готовят на основе солевых растворов, которые имеют состав солей, качественно и количественно приближающийся к составу жидкостей животного организма.

Таблица 1

Состав основных солевых растворов (в г на л)

Вещества

Раствор Хенкса

Раствор Эрла

NaCl

8,0

6,8

KCl

0,4

0,4

CaCl2

0,14

0,2

MgSO4×7H2O

0,1

0,1

MgSO4×6H2O

0,1

-

NaH2PO4×H2O

-

0,125

NaH2PO4×2H2O

0,06

-

KH2PO4

0,06

-

Глюкоза

1,0

1,0

Фенолрот (не всегда)

0,02

0,05

NaHCO3

0,35

2,2

Различают:

  1. Естественные питательные среды (применяются редко).

Естественные питательные среды готовят на основе солевых растворов Хенкса и Эрла, к которым добавляют сыворотку, амниотическую жидкость, эмбриональный экстракт. Эти биологические жидкости являются источниками белкового питания, витаминов и других веществ, способствующих росту и размножению клеток. Например, среда для культивирования клеток HeLa: сыворотка человека – 50%, куриный эмбриональный экстракт – 2%, раствор Хенкса – 48%.

  1. Ферментативные гидролизаты белковых веществ.

В среды добавляют ферментативные гидролизаты: лактальбумина, казеина, белков крови крупного рогатого скота.

  1. Синтетические питательные среды, которые отличаются сложным составом:

Среда 199 (Паркера) содержит 20 аминокислот,17 витаминов, пурины и пиримидины, глюкозу, 9 минеральных солей и ряд других веществ. Эту среду готовят на солевом растворе Хенкса, стерилизуют фильтрованием через бактериальные фильтры.

Среда Игла содержит 13 аминокислот, 4 катиона, 3 аниона, 6 витаминов, холин, инозит и углеводы.

1.2.2. Типы клеточных культур

Для приготовления культур клеток используют различные ткани животных, человека и птиц как эмбриональные, так и зрелые. Кроме нормальных используют и злокачественные перерождённые ткани, получаемые из опухолей.

Источником эмбриональной ткани часто служит куриный зародыш, а также эмбрионы человека, мышей, свиней, кроликов и др. Эмбриональная и опухолевая ткани отличаются лучшей выживаемостью и более активным ростом, чем ткани взрослого организма. Из зрелых тканей чаще всего употребляется почечная ткань (обезьян, морских свинок, хомячков и др.), амниотическая оболочка человека.

Ткани берут в асептических условиях, промывают в солевом растворе Хенкса и затем подвергают измельчению. В вирусологии используют только культуры растущих тканей, которые подразделяют на:

1. Культуры фиксированных кусочков тканей.

2. Однослойные культуры клеток:

а) первичные культуры клеток;

б) перевиваемые (стабильные) культуры клеток;

в) культуры диплоидных клеток.

3. Культуры суспензированных клеток.

В практической вирусологии чаще используют однослойные культуры, клетки которых растут и размножаются будучи прикреплёнными к твёрдому субстрату (стеклу, пластику), образуя слой толщиной в одну клетку (монослой). Метод обработки однослойных культур клеток основан на обработке исходной ткани ферментами (обычно трипсином), разрушающими межклеточные связи; ткань диспергируется, и образуется взвесь изолированных клеток. При культивировании клетки прикрепляются к стеклу сосуда и растут в виде сплошного монослоя, благодаря чему удобно воздействовать на клетки, заражая их вирусами, и визуально наблюдать возникающие изменения в динамике.

а) Первичные культуры клеток способны размножаться только в первой генерации

Методика получения первичных культур фибробластов куриного эмбриона

  1. Яйца, инкубированные 7-11 дней, овоскопируют. Убедившись в жизнеспособности эмбриона, очерчивают границу воздушного мешка.

  2. Скорлупу на тупом конце яйца протирают спиртом, йодом, снова спиртом, а затем срезают на уровне воздушного мешка.

  3. Извлекают эмбрион и помещают его в стерильную чашку, удаляют голову. Тело эмбриона омывают 3-5 мл раствора Хенкса, который затем отсасывают.

  4. Тело эмбриона тщательно измельчают ножницами, полученные кусочки (размером около 1 мм3) пипеткой переносят в пробирку.

  5. Проводят 2-3-кратное отмывание измельчённой ткани от крови. Каждый раз наливают в пробирку с тканью по 2-3 мл раствора, дают ткани осесть, после чего жидкость отсасывают.

  6. К отмытой ткани добавляют 3 мл 0,25% раствора трипсина и тщательно перемешивают содержимое пробирки с помощью «пипетирования» (многократного насасывания и выдувания жидкости пипеткой) или энергичного встряхивания. Под действием трипсина клетки ткани разъединяются и образуют суспензию, поэтому после оседания более крупных тканевых частиц на дно пробирки жидкость над осадком должна остаться мутной.

  7. Верхний помутневший слой жидкости, содержащий взвесь изолированных клеток, переносят в центрифужную пробирку, куда заранее наливается 2,5 мл питательной среды гидролизата лактальбумина. Проводят центрифугирование при 1 000 об/мин в течение 10-15 минут.

  8. Надосадочную жидкость удаляют, к осадку клеток добавляют 2-3 мл гидролизата лактальбумина и тщательно перемешивают, чтобы клетки вновь оказались во взвешенном состоянии. Для отделения конгломератов клеток, которые могут попасть во взвесь, рекомендуется последующее фильтрование через сетку из нержавеющей стали или марлю.

  9. Производится подсчёт клеток в камере Горяева под малым увеличением микроскопа. Определив концентрацию клеток во взвеси, её разводят гидролизатом лактальбумина до 400 000 клеток в 1 мл.

  10. Взвесь разливают в пробирки по 1 мл, закрывают резиновыми пробками и помещают в термостат при 370С в наклонном положении под углом 50.

Через 3-4 суток от начала культивирования, просматривая пробирки при малом увеличении микроскопа, можно видеть вытянутые, отростчатые клетки – фибробласты, которые растут на стенке пробирки, образу монослой.

б) Перевиваемые культуры клеток (линии клеток)

Это стабильные культуры клеток, которые способны бесконечно долго размножаться вне организма, если их культивировать в соответствующих условиях. Например, перевиваемые культуры из амниона человека (FL, А-8), почки обезьян (VERO - от зелёной мартышки, LLCMK 2 – от макаки-резус), эмбриона мыши (ЗТЗ), из опухолевых клеток человека (HeLa - из рака шейки матки, Нер–2 – из рака гортани) и многие другие.

Перевиваемые культуры клеток обладают целым рядом преимуществ по сравнению первичными. Работа с ними менее трудоёмка, они отличаются большим диапазоном чувствительности ко многим вирусам. Однако перевиваемые культуры не пригодны для производства вирусных вакцин, так как существуют опасения по поводу их возможной злокачественности.

Перевиваемые культуры клеток без пересева на свежую среду довольно быстро дегенерируют. Поэтому исходную культуру клеток выращивают в матрацах с питательной средой, еженедельно пересевая культуру в новые сосуды. При работе с пробирочными культурами также рекомендуется пересевать их через 7-8 дней, или же раз в 3-4 дня заменять питательную среду свежей, тогда клеточные культуры сохраняют свою жизнеспособность 2-3 недели.

Для культивирования перевиваемых культур клеток применяют среду 199 (часто с добавлением 10% бычьей сыворотки), среду Игла с добавлением 20% сыворотки, 0,5% гидролизат лактальбумина, содержащий 5% телячьй сыворотки.

в) Культуры диплоидных клеток

Их называют полуперевиваемыми культурами, так как ини обладают способностью к пересевам в течение длительного времени – выдерживают до 40-50 пассажей, проводимых на протяжении 8-10 месяцев. Затем культура клеток дегенерирует и гибнет. Диплоидными их называют , потому что они стойко сохраняют диплоидный кариотип, присущий исходным нормальным клеткам организма – родоначальницам диплоидной линии.

Культуры диплоидных клеток получают из различных тканей эмбриона человека, из первичных культур. Так, например, пользуется известностью штамм ДКЛЧ (диплоидные клетки лёгких человека), штаммы WJT-38, JMR-90, MRC-5 из лёгких ткани эмбриона человека.

Диплоидные культуры применяют для выделения и культивирования вирусов. Они чувствительны ко многим штаммам вирусов, онкогенно безопасны, пригодны для культивирования в промышленных масштабах и получения массового количества вирусных вакцин.

Рис. 2. Культуры клеток

Культуры суспензированных клеток

Суспензированная культура – это культура, в которой отдельные клетки или их конгломераты постоянно находятся во взвешенном состоянии в жидкой среде.

Культуры клеток в суспензии удаётся получить, если проводить их культивирование при постоянном интенсивном перемешивании среды путём вращения пробирок в барабане, с помощью магнитной мешалки и т.п. В последнее время используют специальные аппараты – хемостаты, в которых обеспечивается автоматическое обновление среды. Суспензированные клетки обладают большей активностью роста, накапливаются в большом количестве, при регулярной замене среды длительное время остаются жизнеспособными.


1.3. Культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах

Многие вирусы, поражающие человека и животных, могут в большей или меньшей степени размножаться в курином эмбрионе. Наличие плотной скорлупы защищает эмбрион от попадания микроорганизмов из внешней среды.

Метод культивирования вирусов в куриных эмбрионах используют при лабораторной диагностике вирусных инфекций, а также для изготовления вирусных вакцин и диагностических препаратов. Но этот метод имеет недостатки: 1) невозможно наблюдать в динамике за патологическими изменениями, происходящими в эмбрионе после заражения его вирусом; 2) при вскрытии эмбриона, зараженного вирусом, часто не обнаруживается видимых изменений и приходится выявлять наличие вируса в тканях, в жидкостях эмбриона, пользуясь другими вирусологическими методами (например, реакцией гемагглютинации); 3) метод культивирования в куриных эмбрионах пригоден не для всех вирусов. Несмотря на имеющиеся недостатки метод сравнительно прост, удобен и дешев и широко используется в вирусологических исследованиях. Наибольшее значение он имеет при работе с ортомиксовирусами, герпесвирусами, поксвирусами.

1.3.1. Строение куриного эмбриона

Куриный эмбрион покрыт известковой оболочкой – скорлупой, к которой изнутри примыкает скорлупная оболочка. В тупом конце яйца она раздваивается и заключает в себе воздушное пространство. Под скорлупной оболочкой находится хорионаллантоисная оболочка, в тупом конце яйца она проходит по внутренней стороне скорлупной оболочки, замыкающей воздушное пространство, эта оболочка богата кровеносными сосудами и служит эмбриону органом дыхания. Изнутри к ней прилегает аллантоисная полость, которая является органом выделения и защищает зародыш от высыхания и травм. Аллантоисная полость окружает зародыш, находящийся в полости амниона, которая наполнена околоплодной жидкостью. Через желточный канатик зародыш соединён с желточным мешком – основным источником питательных веществ.

Для успешного культивирования вирусов в организме развивающихся куриных эмбрионов требуется определённый температурный режим (360-380), влажность (50-70%), а также достаточная вентиляция. Заражают куриные эмбрионы определённого возраста, инкубированные от 6 до 13 дней в зависимости от вида вирусов и метода заражения. Необходимо подготовить: подставку для яйца, пузырьки со спиртом и йодом, пробирку со стерильным парафином, покровные стёкла, пакетики стерильной ваты и марли, завёрнутую в бумагу стерильную посуду, стерильные шприцы, иглы, пинцеты, препаровальные иглы. Инструменты помещают в стаканчик со спиртом, где они находятся в течение всей работы, перед каждой манипуляцией их дополнительно стерилизуют обжиганием в пламени горелки. Руки перед работой тщательно моют, рекомендуется надеть маску из марли.

Для работы отбирают жизнеспособные эмбрионы, просвечивая инкубированные яйца в овоскопе. Жизнеспособный эмбрион подвижен, кровеносные сосуды оболочки заполнены кровью. Отобранные яйца тщательно дезинфицируют на тупом конце (или на боковой стороне яйца): скорлупу протирают спиртом, смазывают йодом, повторно обрабатывают спиртом и обжигают.

1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку

Для заражения используют куриные эмбрионы 10-12-дневного возраста. Основные этапы заражения:

  1. Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху, проводят стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца.

  2. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.

  3. в образовавшееся отверстие вводят браншу ножниц и вырезают окно в скорлупе около 1,5 см в диаметре.

  4. Через отверстие осторожно надрывают иглой внутренний листок скорлупной оболочки и отслаивают на небольшом участке (0,5-1 см2).

  5. Производят заражение хорионаллантоисной оболочки путём нанесения на неё 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала с помощью пастеровской пипетки или шприца.

  6. Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной плёнкой или стерильным покровным стеклом и прикрепляют расплавленным парафином.

Заражённые эмбрионы помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют в течение 2-3 суток, после чего производят вскрытие по следующим правилам:

  1. Яйцо помещают на подставку так, чтобы воздушное пространство было наверху, проводится стерилизация места вскрытия.

  2. Стерильными ножницами срезают скорлупу по границе воздушного пространства.

  3. Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболочку по границе. Обнажённую хорионаллантоисную оболочку подрезают вдоль края скорлупы. Через образовавшееся отверстие выливают всё содержимое яйца в чашку или лоток.

  4. Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в стерильную чашку с физиологическим раствором. Здесь её расправляют и изучают изменения, поместив чашку на тёмный фон.

Для получения из хорионаллантоисной оболочки материала, содержащего вирус, её нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10-15 минут и надосадочная жидкость используется в качестве вируссодержащего материала.



Рис. 3. Заражение куриных эмбрионов

1.3.3. Заражение в аллантоиную полость

Для заражения берут эмбрионы 10-11-дневного возраста. Основные этапы заражения:

  1. Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством.

  2. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.

  3. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение вируса. Иглу продвигают в вертикальном направлении на 2-3 мм ниже уровня воздушного мешка и затем вводят 0,1-0,2 мл материала.

  4. Отверстие в скорлупе заделывают с помощью расплавленного стерильного парафина.

Заражённые эмбрионы выдерживают в термостате обычно в течение 2 суток. Перед вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 40С. Вскрытие производится в следующем порядке:

  1. Яйцо устанавливается на подставке так, чтобы воздушный мешок находился наверху, скорлупу над ним стерилизуют.

  2. С помощью ножниц скорлупу срезают немного выше границы воздушного пространства.

  3. Осторожно удаляют пинцетом скорлупную оболочку, после чего хорионаллантоисную оболочку прокалывают пастеровской пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную жидкость.

  4. Аллантоисную жидкость переносят в стерильную пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на бактериологическую стерильность.

1.3.4. Заражение в полость амниона

Для заражения используют эмбрионы 7-12-дневного возраста. Заражение в амниотическую полость проводят открытым или закрытым методом.

Техника открытого метода заражения:

  1. Яйцо помещают на подставку и проводят стерилизацию скорлупы в области тупого конца.

  2. Над центром воздушного пространства в скорлупе ножницами вырезают окошко величиной 2 см в поперечнике.

  3. Осторожно снимают внутренний листок скорлупной оболочки с помощью пинцета, обнажая подлежащую хорионаллантоисую оболочку.

  4. Прорезают ножницами небольшое отверстие в хорионаллантоисной оболочке в том месте, где нет кровеносных сосудов, и вводят в прорез глазной пинцет. Пинцетом захватывают оболочку амниона и вытягивают амниотический мешок над поверхностью хорионаллантоисной оболочки.

  5. Удерживая амниотическую оболочку в этом положении, производят заражение в полость амниона, вводя шприцем 0,1-0,2 мл разведения вируса.

  6. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, пользуясь для фиксации и герметизации яйца расплавленным парафином.

Заражённые эмбрионы инкубируют в течение 2 суток, выбраковывая погибшие в течение первых суток. Затем эмбрионы выдерживают в течение ночи в холодильнике при 40С.

Техника вскрытия эмбриона при заражении в амниотическую полость:

  1. Простерилизовав место предстоящего вскрытия, срезают скорлупу немного выше края воздушного мешка.

  2. Прокалывают хорионаллантоисную оболочку пастеровской пипеткой и удаляют аллантоисную жидкость.

  3. Захватив пинцетом амниотический мешок, прокалывают его оболочку иглой шприца или пастеровской пипеткой и насасывают амниотическую жидкость (от 0,5 до 1,5 мл). У заражённого эмбриона жидкость должна быть мутной, между тем как у нормального эмбриона она прозрачна.

  4. Взятую жидкость переносят в стерильную пробирку. 0,1-0,3 мл засевают в бульон для контроля на бактериологическую стерильность.

1.4. Культивирование вирусов путём заражения лабораторных животных

Восприимчивые к изучаемым вирусам животные называются экспериментальной моделью. Взятые в опыт животные должны быть одного вида, определённого возраста и содержаться в одинаковых условиях.

Таблица 2

Экспериментальные модели для некоторых вирусов

Наименование вируса

Экспериментальная модель

Вирус бешенства

Вирус Коксаки

Вирус полиомиелита

Вирус гриппа

Вирус клещевого энцефалита

Мыши, кролики

Мыши-сосунки

Обезьяны, крысы

Мыши, хорьки

Мыши

Для вирусологической работы чаще всего используют так называемые «чистые линии» экспериментальных животных. Они обладают однотипной наследственностью, имеют минимальное число латентных инфекций, обладают высокой восприимчивостью к вирусам. Особенно чувствительны к вирусам животные-гнотобионты. Работу животными рекомендуется проводить в настольном боксе или в специальной операционной вивария. Все отходы и трупы погибших животных автоклавируют и сжигают.



Рис. 4. Лабораторное животное

При вирусологических исследованиях применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражение лабораторных животных.

1.4.1. Интраназальное заражение

Метод используют для выделения пневмотропных вирусов. Заражение мышей проводится под эфирным наркозом. Животных помещают в закрытую стеклянную банку, в которую положен кусок ваты, пропитанный эфиром. С помощью шприца или пастеровской пипетки в ноздри животного вводят 0,03-0,1 мл заражающего материала. За животными устанавливается наблюдение, при проявлении признаков заболевания мышей забивают при помощи эфирного наркоза, а затем вскрывают.

Этапы вскрытия животных:

  1. Увлажнённый 5%-ным раствором лизола или фенола труп мыши фиксируют брюшком кверху на поверхности кюветы со смесью воска и парафина.

  2. Обрабатывают кожные покровы спиртом, йодом и вновь спиртом; опаливают пламенем.

  3. Ножницами делают продольный разрез кожи от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы к лапкам, отсепаровывают её.

  4. Вскрывают грудную полость, вырезав грудину ножницами по рёберным хрящам.

  5. Осматривают внешний вид органов грудной полости, обращая внимание на наличие экссудата. Извлекают лёгкие при строгом соблюдении асептики и сохраняют их при минусовой температуре в морозильнике до получения ответа на бактериологический контроль-результат посева кусочка легочной ткани в мясо-пептонный бульон (после выдерживания его в термостате при 370С в течение суток).

  6. При отрицательном контроле на бактериальную загрязнённость готовят 10%-ную суспензию легочной ткани путём растирания ткани в фарфоровой ступке, с постепенным добавлением физиологического раствора.

  7. Суспензию центрифугируют для осаждения крупных частиц при 1500 об/мин, надосадочную жидкость собирают и используют для последующего вирусологического исследования.

1.4.2. Интрацеребральное заражение

Метод предназначен для выделения нейротропных вирусов. При заражении мыши в мозг её плотно прижимают левой рукой к столу, большим и указательным пальцами оттягивают кожу головы к затылку, мизинцем и безымянным фиксируют хвост. Лобный участок головы предварительно обрабатывают 3%-ной йодной настойкой. Заражающий материал (кровь) в объёме 0,02-0,03 мл вводят в мозг туберкулиновым шприцем с тонкой иглой путём прокола лобной кости на глубину 1,5-2 мм.

Этапы вскрытия животных:

  1. Труп увлажняют раствором лизола или фенола.

  2. Обрабатывают кожные покровы головы последовательно спиртом, йодом и вновь спиртом, опаливают пламенем.

  3. Вскрывают и отделяют кожу головы. Отрезают голову, помещают её в стерильную чашку Петри, проведя предварительно через пламя горелки.

  4. Вскрывают ножницами черепную коробку, извлекают мозг и сохраняют его в замороженном состоянии до получения результата бактериологического контроля.

  5. В случае отрицательного бактериологического контроля из мозговой ткани приготавливают 10%-ную суспензию в физиологическом растворе. Освобождают её от крупных тканевых частиц центрифугированием, надосадочную жидкость используют для вирусологической работы.

На лабораторных животных проводят титрование вирусов, ставят реакцию нейтрализации; животных используют для получения вирусных вакцин, диагностикумов, противовирусных сывороток.


Контрольные вопросы

  1. Назовите и охарактеризуйте методы электронной микроскопии, применяемые при изучении вирусов.

  2. Применение светового микроскопа для обнаружения вирусов. Примеры.

  3. Объясните, что понимают под тканевым (оранным) тропизмом вирусов.

  4. Солевые растворы и питательные среды, используемые для культивирования культур клеток. Их состав. Примеры.

  5. Назовите и охарактеризуйте основные типы культур клеток.

  6. Первичные культуры клеток. Принципы приготовления этих культур.

  7. Перевиваемые культуры клеток. Их характеристика.

  8. Диплоидные культуры клеток. Их характеристика.

  9. Применение культур клеток в вирусологии, их преимущества и недостатки.

  10. Строение развивающегося куриного эмбриона (КЭ) и подготовка инкубированных КЭ к заражению. Способы заражения КЭ.

  11. Преимущества и недостатки культивирования вирусов в КЭ.

  12. Культивирование вирусов в организме восприимчивого животного. Способы заражения.

  13. Применение экспериментальных животных в вирусологии, преимущества и недостатки.

  1   2   3

Похожие:

Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201. 65 Биология iconПрограмма предназначена для изучения предмета «Общая биология»
Программа предназначена для изучения предмета «Общая биология» в 9 классах общеобразовательных школ, рассчитана на 2 часа классных...
Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201. 65 Биология iconПояснительная записка Программа предназначена для изучения предмета «Общая биология»
Программа предназначена для изучения предмета «Общая биология» в 9 классах в общеобразовательном учреждении и рассчитана на 2 часа...
Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201. 65 Биология iconМетодические указания настоящие методические рекомендации составлены в соответствии с тематическим планом изучения курса «Арбитражный процесс»
Сборник методических материалов для студентов факультета внебюджетного образования по специальности 030501 «Юриспруденция» (гражданско...
Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201. 65 Биология iconМетодические рекомендации по подготовке к практическим занятиям студентов специальности 050401 «История»
Методические рекомендации для практических занятий составлены в соответствии с программой курса «История России» и предназначены...
Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201. 65 Биология iconКафедра «туризм и сервис» методические рекомендации по подготовке к зачетам и экзаменам для студентов 5 курса заочной формы обучения (специальность 080507 «Менеджмент организации», на базе среднего общего образования)
Методические рекомендации предназначены для студентов и преподавателей, интересующихся вопросами менеджмента организации
Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201. 65 Биология iconМетодические рекомендации по выполнению практической работы №5 «Расчет газопровода жилого дома»
Методические рекомендации предназначены для студентов третьего курса специальности 270111 «Монтаж и эксплуатация оборудования и систем...
Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201. 65 Биология iconМетодические рекомендации по выполнению практической работы №1 «Определение расчетных расходов газа»
Методические рекомендации предназначены для студентов третьего курса специальности 270111 «Монтаж и эксплуатация оборудования и систем...
Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201. 65 Биология iconМетодические указания по организации самостоятельного выполнения выпускных квалификационных работ для студентов специальностей 030508, 03050801, 03050801 «Финансы и кредит» всех форм обучения
Методические указания по организации самостоятельного выполнения выпускных квалификационных работ / составители: П. В. Тархов, В....
Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201. 65 Биология iconМетодические рекомендации для студентов озо
Методические рекомендации предназначены студентам заочного отделения в целях улучшения их профессионально педагогической подготовки....
Методические рекомендации по организации самостоятельного изучения курса «Общая вирусология» Для специальности 020201. 65 Биология iconМетодические рекомендации (заочное обучение) по дисциплине «Биология»
Методические рекомендации подготовлены преподавателем кафедры зоотехнии, лейтенантом внутренней службы О. С. Попцовой
Разместите кнопку на своём сайте:
Библиотека


База данных защищена авторским правом ©lib2.znate.ru 2012
обратиться к администрации
Библиотека
Главная страница