Приготовление реагентов

Скачать 12.01 Kb.

Название	Приготовление реагентов
Дата	03.02.2016
Размер	12.01 Kb.
Тип	Документы

Реахром-гепарин

Набор реагентов для определения анти Ха

активности гепарина оптическим методом.

Набор предназначен для определения анти Ха активности гепарина как не фракционированного, так и низкомолекулярного, в плазме пациентов. Основным ингибитором тромбина, активированного фактора Xa и других сериновых протеаз коагуляционного каскада является антитромбин III (ATIII). В нормальных условиях скорость ингибирования мала, но она возрастает в несколько тысяч раз в присутствии гепарина. Этот механизм объясняет антикоагулянтное действие гепарина. Препараты низкомолекулярного гепарина в комплексе с АТIII ингибируют действие активированного фактора Xа в гораздо большей степени, чем тромбина. По этой причине тест ингибирования активности фактора Xa является наиболее чувствительным и информативным из всех способов определения активности гепарина в плазме крови.

Принцип метода.

Метод определения активности гепарина основан на способности комплекса АТIII-гепарин нейтрализовать активированный фактор Ха. Активность гепарина определяют в плазме, добавляя к ней избыток антитромбина III и фактора Xa. При этом происходит ингибирование фактора Xa комплексом АТIII-гепарин пропорционально количеству гепарина в плазме. Оставшееся количество фактора Xa катализирует отщепление пара-нитроанилина (рNА) от синтетического хромогенного субстрата. Абсорбция свободного pNA, определяемая при 405 нм, обратно пропорциональна активности гепарина в плазме.

Процесс идет по следующей схеме:

АТIII (избыток) + гепарин  АТIII-гепарин.

АТIII-гепарин + Xa (избыток)  АТIII-гепарин-Xa+Xa (остаток).

Субстрат-рNA + Xa (остаток)  Пептид + рNA.

Состав набора.

Антиромбин III (1мл), лиофильно высушенный – 2 фл.

Фактор Xa (2мл), лиофильно высушенный – 2 фл.

Буфер концентрированный (5мл) – 1фл.

Хромогенный субстрат, лиофильно высушенный (2мл) – 2фл

Приготовление реагентов.

Рабочий буферный раствор. Буфер концентрированный (5 мл) развести дистиллированной водой в 20 раз (1:19). Рабочий буферный раствор должен иметь рН=8,4  0,05. Хранить при температуре 2-8⁰С не более 20 дней.
Рабочий раствор антитромбина III. Во флакон с лиофильно высушенным антитромбином III внести 1 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при осторожном покачивании. Реагент готов к проведению анализа через 20 минут после разведения.
Рабочий раствор фактора Ха. Во флакон с лиофильно высушенным фактором Ха внести 2 мл дистиллированной воды, растворить при осторожном покачивании. Реагент готов к проведению анализа через 20 минут после разведения.
Раствор хромогенного субстрата. Во флакон с хромогенным субстратом внести 2 мл дистиллированной воды, растворить при осторожном покачивании. Реагент готов к проведению анализа через 20 минут после разведения.

Стабильность реагентов.

Реагенты	+2-8⁰С	+18-22⁰С	-18-20⁰С
Рабочий раствор антитромбина III	3 дня	1 день	2 мес.
Рабочий раствор фактора Ха	3 дня	1 день	2 мес.
Раствор хромогенного субстрата	10 дней	2 дня	2 мес.

Дополнительные реагенты.

Цитрат натрия 0.11М (3.8%) раствор.

Уксусная кислота 50% концентрации.

Получение исследуемой плазмы для анализа.

В

енозную кровь взять в пластиковую или стеклянную силиконированную пробирку на 3,8% (0.11моль/л) цитрате натрия (9:1), центрифугировать 7 мин при 1000 об/мин, плазму перенести в другую пробирку и повторно центрифугировать 15 мин при 3000 об/мин. Центрифугирование следует проводить как можно скорее плазму в

пластиковую пробирку. Для анализов достаточно 0,2 мл бедной тромбоцитами плазмы. Время хранения при комнатной температуре - не более 2 часов, при 2 - 8С не более 8 часов. Допускается однократное замораживание плазмы при температуре - 20⁰С.

Построение и использование калибровочного графика.

Для построения калибровочного графика используют плазмы-калибраторы с известными активностями низкомолекулярного гепарина (поставляются дополнительно, не входят в состав набора).

1. Развести исследуемую плазму или плазмы-калибраторы трех уровней рабочим буферным раствором в 2 раза по схеме:

0.1мл плазмы + 0.1мл рабочего буферного раствора. - Раствор 1:

2. Непосредственно перед проведением анализа приготовить реакционную смесь по схеме - Раствор 2:

Рабочий буферный раствор	400 мкл
Рабочий раствор антитромбина III	100 мкл
Раствор 1	100 мкл

Проведение анализа.

Анализ проводится в пластиковых пробирках, прогретых при 37⁰С.

Внести в пробирку:	Образец	Кювета сравнения
Рабочий раствор фактора Xa	200 мкл	-
Раствор 2	200 мкл	-
Рабочий буферный раствор	-	1000мкл
Инкубировать при 37⁰С точно 5 минут.		-
Раствор хромогенного субстрата	200 мкл	-
Инкубировать при 37⁰С точно 5 минут.		-
50%-ая уксусная кислота	400 мкл	-

Измерить оптическую плотность образца против кюветы сравнения на спектрофотометре (ФЭКе) при длине волны 405 нм.

На оси ординат (Y) по линейной шкале отложить величины оптической плотности, полученные для каждой плазмы-калибратора, а на оси абсцисс (Х) по линейной шкале отложить активность гепарина в анти-Xa единицах в мл плазмы. Калибровочный график линеен в интервале активности гепарина от 0 до 1.0 анти-Xa ед/мл. Используя калибровочный график и значение оптической плотности исследуемого образца определить активность гепарина в анти-Xa единицах.

Интерпретация результатов.

Терапевтическая область 0,3-0,7 анти- Xa активность.

Профилактическая область 0,1-0,3 анти- Xa активность.

Образцы исследуемой плазмы с высоким уровнем активности гепарина могут полностью нейтрализовать фактор Xa в системе, что приводит к искажению результатов. Поэтому точные значения активности гепарина для таких образцов могут быть получены при разведении исследуемой плазмы в 4 или в 8 раз рабочим буферным раствором (Раствор 1). При этом результат, считанный из калибровочного графика, должен быть умножен на 2 или 4 соответственно.

Завышенные результаты могут быть получены при анализе образцов плазм больных:

с повышенным содержанием липидов;
с повышенным содержанием билирубина.

Контроль качества.

Для построения и проверки правильности построения калибровочных прямых необходимо контролировать с помощью гепаринизированных плазм НПО РЕНАМ:

Плазма- калибратор код ГП-3

Плазма контрольная код ГП-4

Паспорт

Набора реагентов для определения активности гепарина

Реахром гепарина-тест

Серия № 0405 Годен до: 12.06

№ п/п	Наименование показателя	По ТУ	Фактическое значение
1	Внешний вид антитромбина III	Пористая масса белого цвета	Соответствует
2	Внешний вид фактора Xa	Пористая масса, белого цвета	Соответствует
3	Внешний вид буфера концентрированного	Прозрачная бесцветная жидкость	Соответствует
4	Внешний вид хромогенного субстрата	Пористая масса белого цвета	Соответствует
5	Растворимость антитромбина III и фактора Xa, мин. не более	3	Соответствует
6	Растворимость хромогенного субстрата, мин. не более	3	Соответствует
7	Чувствительность, анти-Xa ед/мл, не более	0.02	Соответствует
8	Линейность в диапазоне активности 0-1.0 анти-Xa ед/мл, отклонение в % не более	10	Соответствует
9	Коэффициент вариации результатов определения, % не более	10	Соответствует

ОТК

Разработчик и изготовитель:

НПО“РЕНАМ” Общества больных гемофилией

125167 Москва, Ново-Зыковский пр., 4а

Тел. (095) 213-00-72, 212-51-03

Похожие:

	Приготовление реагентов Набор реагентов для определения активности антитромбина III оптическим методом		Программа вступительного испытания Прием продовольственного сырья и пищевых продуктов, их транспортирование, хранение, механическая и гидромеханическая обработка. Приготовление...
	«Изделия из теста. Приготовление вареников, ватрушек» Оборудование: компьютер, проектор, презентация «Виды теста. Приготовление вареников, ватрушек». Инструкционные карты. Книги, журналы....		Приготовление пирогов из дрожжевого теста Выполнила Приданникова Людмила Дмитриевна, учитель технологии моу «Октябрьская сош»
	Примерная программа профессионального модуля Приготовление блюд и гарниров из круп, бобовых, макаронных изделий, яиц, творога, теста		Рабочая программа профессионального модуля Пм приготовление блюд и гарниров из круп, бобовых, макаронных изделий, яиц, творога и теста
	Тесты для 11 класса Кулинария Приготовление пищи путем нагревания продукта с жиром при температуре 140-220˚С называется		Приготовление бисквитного теста и изделий из него Мдк. 08. 01. Технология приготовления хлебобулочных, мучных и кондитерских изделий
	Учебного занятия по дисциплине «Технология приготовления мучных кондитерских изделий» (4 курс) по теме «Приготовление бисквитного полуфабриката» для специальности 260502 Технология продукции общественного питания Методическая разработка учебного занятия по дисциплине «Технология приготовления мучных кондитерских изделий» (4 курс) по теме «Приготовление...		Повар, кондитер базовой подготовки Профессиональные компетенции Ком предназначен для контроля и оценки результатов освоения профессионального модуля пм. 05. Приготовление блюд из мяса и домашней...

Разместите кнопку на своём сайте:
Библиотека