Приготовление реагентов

Скачать 13.39 Kb.

Название	Приготовление реагентов
Дата	03.02.2016
Размер	13.39 Kb.
Тип	Документы

Реахром-АТIII

Набор реагентов для определения активности антитромбина III оптическим методом.

Антитромбин III (ATIII) или ко-фактор гепарина – основной антагонист тромбина при образовании этого фермента в крови. Он является единственным ингибитором свертывания крови, врожденный дефицит которого клинически проявляется тромбозами. В отсутствии гепарина АТIII медленно и необратимо ингибирует тромбин и другие факторы свертывания и фибринолиза. В присутствии гепарина АТIII становится быстрым ингибитором этих ферментов. Наследственный и приобретенный дефицит АТIII в крови приводит к развитию диссеминированного внутрисосудистого свертывания и в некоторых случаях острых тромбозов. Сниженная концентрация АТIII наблюдается у больных с заболеваниями печени (при циррозе), с нефротическим синдромом в результате экскреции ингибитора с мочой. Концентрацию АТIII снижают оральные контрацептивы и инъекции гепарина.

Принцип метода.

Метод определения активности АТIII основан на способности АТIII нейтрализовать тромбин в присутствии гепарина. Активность АТIII определяют в плазме, добавляя к ней избыток тромбина. При этом происходит ингибирование тромбина комплексом АТIII-гепарин пропорционально количеству АТIII в плазме. Оставшееся количество тромбина катализирует отщепление пара-нитроанилина (рNА) от синтетического хромогенного субстрата. Абсорбция свободного pNA, определяемая при 405 нм, обратно пропорциональна активности АТIII.

Процесс идет по следующей схеме:

АТIII + гепарин (избыток)  АТIII-гепарин.

АТIII-гепарин + тромбин (избыток) 
АТIII-гепарин-тромбин + тромбин (остаток).

Субстрат-рNA + тромбин (остаток)  Пептид + рNA.

Состав набора:

Буфер с гепарином концентрированный (5мл) – 2фл.

Тромбин человека (10 NIH/фл, 2.5мл), – 2 фл.

Плазма-калибратор, лиофильно высушенная (1мл) – 1 фл.

Хромогенный субстрат, лиофильно высушенный (2мл) – 2фл

Приготовление реагентов.

Рабочий буферный раствор. Буфер с гепарином концентрированный (5 мл) развести дистиллированной водой в 10 раз (1:9). Рабочий буферный раствор должен иметь рН=8,4  0,05. Готов к проведению анализа через 20 минут после разведения. Хранить при температуре 2-8⁰С не более 10 дней.
Рабочий раствор тромбина. Во флакон с лиофильно высушенным тромбином внести 2.5 мл дистиллированной воды и растворить содержимое при осторожном покачивании. Готов к проведению анализа через 20 минут после разведения.
Раствор плазмы-калибратора. Во флакон с плазмой-калибратором внести 1 мл дистиллированной воды, растворить при осторожном покачивании. Готов к проведению анализа через 20 минут после разведения.
Раствор хромогенного субстрата. Во флакон с хромогенным субстратом внести 2 мл дистиллированной воды, оставить без перемешивания на 20 минут, затем содержимое флакона тщательно перемешать

Стабильность реагентов.

Реагенты	+2-8⁰С	+18-22⁰С	-18-20⁰С
Рабочий раствор тромбина	5 дня	2 дня	2 мес.
Раствор хромогеного субстрата	14 дней	5 дней	2 мес.
Раствор плазмы – калибратора	8 часов	8 часов	2 мес.

Получение исследуемой плазмы для анализа.

Венозную кровь взять в пластиковую или стеклянную силиконированную пробирку на 3,8% (0.11моль/л) цитрате натрия (9:1), центрифугировать 7 мин при 1000 об/мин, плазму перенести в другую пробирку и повторно центрифугировать 15 мин при 3000 об/мин. Центрифугирование следует проводить как можно скорее

после взятия крови. Немедленно после центрифугирования перенести плазму в пластиковую пробирку. Для анализов достаточно 0,2 мл бедной тромбоцитами плазмы. Время хранения при комнатной температуре - не более 2 часов, при 2 - 8С не более 8 часов. Допускается однократное замораживание плазмы при температуре - 20⁰С.

Дополнительные реагенты:

Цитрат натрия 0.11М (3.8%) раствор.
Уксусная кислота 50% концентрации.

Построение и использование калибровочного графика.

Для проведения анализа необходимо использовать пластиковые пробирки.

Пробирка №	1	2	3	4
Активность АТIII в %	1.0А	0.5А	0.25А	0.125А
Рабочий раствор буфера, мл	1.9	1.0	1.0	1.0
Плазма-калибратор , мл	0.1	-	-	-
Перемешать и перенести в пробирку, мл	1.0 1.0 1.0

А - активность антитромбина III в плазме-калибраторе, указана в паспорте на набор.

Для построения калибровочного графика используют плазму-калибратор с известной активностью АТIII (А). На оси ординат (Y) по линейной шкале отложить величины оптической плотности, полученных для каждого разведения плазмы-калибратора, а на оси абсцисс (Х) по линейной шкале отложить активность антитромбина III в %.

Калибровочный график линеен в интервале активности АТIII от 10 до 100%.

Проведение анализа.

Непосредственно перед проведением анализа развести исследуемую плазму рабочим буферным раствором в 20 раз по следующей схеме:

0.1мл плазмы + 1.9мл буфера.

Анализ проводится в пластиковых пробирках, термостатируемых при 37⁰С.

Внести в кювету:	Образец	Кювета сравнения
Исследуемая разведенная плазма (или плазма-калибратор)	100 мкл	-
Рабочий раствор тромбина	100 мкл	-
Рабочий раствор буфера	-	1500мкл
Перемешать и инкубировать при 37⁰С точно 180 сек.		-
Рабочий раствор хромогенного субстрата	100 мкл	-
Перемешать и инкубировать при 37⁰С точно 60 сек.		-
50%-ая уксусная кислота	1000 мкл	-

Измерить оптическую плотность образца против кюветы сравнения на спектрофотометре (ФЭКе) при длине волны 405 нм. Используя калибровочный график и значение оптической плотности исследуемого образца определить активность АТIII.

Интерпретация результатов.

Образцы исследуемой плазмы с высоким уровнем активности АТIII могут полностью нейтрализовать тромбин в системе, что приводит к искажению результатов. Поэтому точные значения активности АТIII для таких образцов могут быть получены при разведении исходной плазмы в 40 раз. При этом полученный результат необходимо умножен на 2.

Заниженные результаты могут быть получены при анализе образцов плазм больных:

с повышенным содержанием липидов;
с повышенным содержанием билирубина.

В нормальной плазме здоровых лиц активность антитромбина III составляет 80 - 120%.

Контроль качества.

Нормальные и патологические значения антитромбина III следует контролировать с помощью контрольных плазм НПО РЕНАМ:

Плазма контрольная – 11параметров код КМ-2

Плазма контрольная патологическая – 11параметров код КМ-4

Паспорт

Набора реагентов для определения активности антитромбина III

РеаХром-АТIII тест

Серия № 1905 Годен до: 05.07

№ п/п	Наименование показателя	По ТУ	Фактическое значение
1	Внешний вид тромбина (Серия 0805)	Пористая масса белого цвета	Соответствует
2	Внешний вид концентрата буфера (Серия 0505)	Прозрачная бесцветная жидкость	Соответствует
3	Внешний вид плазмы-калибратора (Серия 4505)	Пористая масса желтого цвета	Соответствует
4	Внешний вид хромогенного субстрата (Серия 1905)	Пористая масса белого цвета	Соответствует
5	Растворимость тромбина и плазмы-калибратора, мин. не более	3	Соответствует
6	Растворимость хромогенного субстрата, мин. не более	20	Соответствует
5	Активность антитромбина III в плазме-калибраторе с. 4505, %	80 - 120	95
6	Допустимое отклонение активности антитромбина III в плазме-калибраторе от аттестованного значения, % не более	10	Соответствует
7	Чувствительность, % не более	10	Соответствует
8	Линейность в диапазоне активности 10-100 %, отклонение в % не более	10	Соответствует
9	Коэффициент вариации результатов определения, % не более	10	Соответствует

ОТК

Разработчик и изготовитель:

МБООИ Общества больных гемофилией

НПО РЕНАМ

1
25167 Москва, Ново-Зыковский пр., 4а

Тел. (095) 213-00-72, 212-51-03

Похожие:

	Приготовление реагентов Атiii ингибируют действие активированного фактора Xа в гораздо большей степени, чем тромбина. По этой причине тест ингибирования...		Программа вступительного испытания Прием продовольственного сырья и пищевых продуктов, их транспортирование, хранение, механическая и гидромеханическая обработка. Приготовление...
	«Изделия из теста. Приготовление вареников, ватрушек» Оборудование: компьютер, проектор, презентация «Виды теста. Приготовление вареников, ватрушек». Инструкционные карты. Книги, журналы....		Приготовление пирогов из дрожжевого теста Выполнила Приданникова Людмила Дмитриевна, учитель технологии моу «Октябрьская сош»
	Примерная программа профессионального модуля Приготовление блюд и гарниров из круп, бобовых, макаронных изделий, яиц, творога, теста		Рабочая программа профессионального модуля Пм приготовление блюд и гарниров из круп, бобовых, макаронных изделий, яиц, творога и теста
	Тесты для 11 класса Кулинария Приготовление пищи путем нагревания продукта с жиром при температуре 140-220˚С называется		Приготовление бисквитного теста и изделий из него Мдк. 08. 01. Технология приготовления хлебобулочных, мучных и кондитерских изделий
	Учебного занятия по дисциплине «Технология приготовления мучных кондитерских изделий» (4 курс) по теме «Приготовление бисквитного полуфабриката» для специальности 260502 Технология продукции общественного питания Методическая разработка учебного занятия по дисциплине «Технология приготовления мучных кондитерских изделий» (4 курс) по теме «Приготовление...		Повар, кондитер базовой подготовки Профессиональные компетенции Ком предназначен для контроля и оценки результатов освоения профессионального модуля пм. 05. Приготовление блюд из мяса и домашней...

Разместите кнопку на своём сайте:
Библиотека